Parte de la historia del juego ocurre en el siglo XXI, teniendo como protagonista a Desmond Miles quien intenta escapar de la corporación Abstergo con la ayuda de Lucy Stillman luego de haber sido forzado a revivir los recuerdos genéticos de su antepasado Altaïr ibn La-Ahad a través de la máquina conocida como "Animus", eventos ocurridos en el primer juego. Luego de escapar, Desmond se ve en la necesidad de acceder un dispositivo similar pero más avanzado (el Animus 2.0) para revivir las memorias de otro de sus antepasados, Ezio Auditore da Firenze, quien vivió durante el período renacentista italiano del siglo XV en Italia. El jugador pasa a controlar entonces a Ezio, quien se convierte en un Asesino luego de una traición a su familia.
